Termín

Přincipem spektrofotometrie je stanovení hledané složky na základě intenzity jejího zbarevní.

Hledaná složka, není-li sama barevná, se musí nechat zreagovat s nadbytkem činidla, se kterým tvoří barevný produkt.
Jde o kvantitativní metodu.

Stanovení se provádějí v roztoku.

Fotometrie
Předchůdcem spektrofotometrie je fotometrie, metoda vizuálního porovnání barvy sledovaného vzorku s barvami kalibrační škály.
Posuzování probíhá v bílém světle, je možné použít filtr doplňkové barvy.
Metoda se nechá připodobnit k vizuálnímu rozeznání silné a slabé kávy (čaje).

Spektrofotometrie
Přístroj spektrofotometr se skládá ze světelného zdroje, kvalitního barevného filtru (rozklad spektra bílého světla na hranolu nebo na mřížce), z kyvety (nádobky) s barevným vzorkem a z optického čidla intenzity světla.
Výsledek měření se obvykle zobrazuje jako absorbance (A), tj. logaritmická funkce úbytku světelného paprsku po průchodu vzorkem.

Lambert-Beerův zákon praví
A = ε.c.l
tzn. že absorbance se rovná součinu absorbčního koeficientu (intenzita zbarvení té které látky), koncentrace barevné látky a délky optické dráhy v kyvetě se vzorkem.

Spektrofotometrie je metodou relativní. Při měření vzorků se měří i kalibrační přímka, z kalibrační přímy se následně odečte koncentrace měřeního roztoku.
Přístroj je třeba nastavit na vlnovou délku (barvu paprsku) absorbčního maxima.
Přístroj je při měření nejlépe kalibrovat proti čistému rozpouštědlu (vodě), byť kalibrační přímka pak nemusí procházet počátkem.
Měření probíhá v oblasti viditelného spektra, cca při 360-760 nm; při měření v UV oblasti, při kratších vlnových délkách je třeba použít křemennou kyvetu.

Teorie
Propustnost T, transmitance je dána poměrem intenzity světelného toku procházejícího vzorkem a intenzity světelného toku procházejícího čistým rozpouštědlem.
T = Φ/Φ₀
Absorbance A (starší pojem extinkce E) je záporný logaritmus T.
A = -log T


Turbidimetrie a nefelometrie
Obdobně fungují metody turbidimetrie a nefelometrie.
Ty se používají pro měření koloidů nebo suspenzí (vybarvení netřeba), kde narozdíl od pravých roztoků neprochází paprsek přímočaře, ale ohýbá se na koloidních nebo suspendovaných částicích.
Turbidimetr má čidlo v ose paprsku, nefelometr v úhlu k ose.